質量分析プロトコール（抗体分子の特性解析編）

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2021/04/04 06:58

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2021/04/04 06:58

ホストセルタンパク質解析編

ホストセルタンパク質解析編Version:2020-1HO動物培養細胞に特定のタンパク質を産生させ、高度に精製したタンパク質製剤であっても、微量のホストセル由来タンパク質(HCP)の混入は避けられない。これらHCP不純物についてはELISAでの品質管理が行われているが課題も多く、より正確なHCP評価には質量分析手法が適していると考えられている。NISTmAbについて質量分析を用いてHCPを測定した報告のうち、Huangら（Anal.Chem.2017,89,5436-5444）は、1ppm以上のレベルで検出されるHCPは50種程度に及ぶことを報告している。このうち10ppmレベル以上のHCPは8種類程度検出されている。質量分析によるHCP解析の多くは、感度の高いオービトラップ型質量分析計や、ナノLCを組み合わせ...ホストセルタンパク質解析編

2020/07/13 10:12

SEC-MSによるオリゴマー解析編

SEC-MSによるオリゴマー解析Version:2020-1HO抗体医薬に含まれる凝集体は、抗原性の原因になる可能性が指摘されており、これについて評価しなければならない。質量分析で行える凝集体評価は、粒子径1～100nm程度を分離対象とするサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によるオリゴマー（2量体、3量体等）の評価に留まる。粒子径100nm～10mmまでの凝集体については、粒子トラッキング法など別の測定手段が用いられる。ここでは、SECとインタクト質量分析を組み合わせて行うオリゴマー（主に2量体）の測定方法について解説する。【材料】カラム：WatersAQUITYUPLCProteinBEHSEC，200Å，1.7µm，2.1x150mm(#186008471)その他、抗体標品、キャリブレーション液等は「抗...SEC-MSによるオリゴマー解析編

2020/04/22 15:19

糖ペプチド解析編

抗体の糖ペプチド解析Version:2020-1xxxxxトリプシン消化によるペプチドマッピングは最も効率のよい、タンパク質の1次構造解析手法である。既知のアミノ酸修飾は、ペプチドマッピングにより解析可能であるが、糖鎖修飾を解析しようとする場合、いくつかの問題点に直面する。そもそも糖ペプチドは感度が悪く、その原因はイオンサプレッションを受けやすい化合物であることが考えられる。また、ペプチドマッピングで通常用いられるC18カラムの分離条件では、糖鎖の違いによる分離がほとんど期待できなことも主な問題点となっている。今回、これら問題点を克服し、糖ペプチドの解析を可能にするプロトコールを作成した。すなわち、糖ペプチドを濃縮する前処理を追加することにより、共溶出する成分による影響を抑え、かつC18カラムの分離条件を一部改...糖ペプチド解析編

2020/04/05 13:10

ペプチドマッピング編

抗体のペプチドマッピングversion2020₋2xxxx、xxxx抗体分子の特性解析においてペプチドマッピングは、アミノ酸配列の確認やアミノ酸残基の修飾割合を把握する上で重要かつ基本的な解析手法である。また、ホストセルタンパク質の検出法としても利用されうる手法である。ここでは、最も基本的なペプチドマッピングについて解説する。プロテオミクスで用いられるタンパク質同定を目的としたペプチドマッピングでは、シーケンスカバー率＊は20%程度であっても同定できれば問題ないのに対し、アミノ酸配列の確認等の特性解析を目的としたペプチドマッピングでは、100%近いシーケンスカバー率が必要となるため、同じペプチドマッピングでも内容は異なる。本プロトコールの方法に従えば、NISTmAbのシーケンスカバー率＊は95%以上（100%）...ペプチドマッピング編

2020/04/02 16:24

更新履歴

◎誤字、脱字等は逐一修正しています。その場合、更新履歴には残しません。◎内容に関して小さな改変、修正、加筆した場合はここに更新履歴として記録します。◎内容について大きな改変がある場合は、バージョンアップしたプロトコールとします。更新履歴

2020/04/02 15:22

サブユニット解析編

抗体のサブユニット解析Ver.2020-2xxxx,xxxx抗体分子(IgG1)を約150kDaのまま測定するインタクト解析では、抗体分子に熱変性以外の処理を加えないため、測定における人為的変化をほとんど受けることなく分子全体の質量分析が行える。これにより糖鎖の不均一性を評価することができる（図1）。しかしながらインタクト解析では、平均質量※でしか評価できないのに対して、抗体分子を約25kDaまで限定分解して測定するサブユニット解析では、モノアイソトピック質量※での評価が可能となる。平均質量での評価の場合、最大7Da程度の誤差を許容する必要があるのに対し、モノアイソトピック質量測定の精度は0.1Da程度まで向上する。このことにより、ペプチドまで分解せずともサブユニットレベルにおいて、糖鎖やアミノ酸残基の不均一性...サブユニット解析編

2020/04/01 08:00

プロトコールを公開するにあたって

抗体分子の特性解析における質量分析抗体医薬を開発する上で、抗体分子の不均一性評価は欠くことのできない研究試験項目である。現状において、動物培養細胞などから作られるタンパク質製剤は均一標品として開発するのは不可能であり、ある程度の不均一性を保った状態で、安全性と有効性が証明されたのち、医薬品として利用されている。したがってタンパク質製剤の場合、どの程度不均一であるかを可能な限り評価し、生物活性や副作用との相関を解析することが求められる。このうち質量分析計を使って行える分析項目は、アミノ酸配列およびアミノ酸残基の修飾の解析、糖鎖付加がある場合には、糖鎖構造の不均一性の解析、その他に、タンパク質凝集体の解析および抗体分子以外の不純物の解析等である。例えば、糖鎖の不均一性評価を行う場合、糖タンパク質を丸ごと測定すること...プロトコールを公開するにあたって

2020/04/01 03:42

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2020/03/31 23:46